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過氧化物酶(POD)活性檢測試劑盒

點擊次數:425 日期:2021/6/21 10:26:11

過氧化物酶(POD)活性檢測試劑盒
規格:50T/48S 
注意:正式測定之前選擇2-3 個預期差異大的樣本做預測定。
產品內容:
提取液:液體 60mL×1 瓶,4℃保存;
試劑一:液體 60mL×1 瓶,4℃保存;
試劑二:液體 0.33mL×2 瓶,4℃保存;用時每瓶加入5mL 試劑一;用不完的試劑4℃保存一周; 
試劑三:液體 10 mL×1 瓶,4℃保存。
產品說明:
POD(EC 1.11.1.7)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物,具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。POD 催化 H2O2 氧化特定底物, 在470nm有特征光吸收。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水
過氧化物酶(POD)活性檢測試劑盒操作步驟:
一、粗酶液提。
1、 細菌、細胞或組織樣品的制備:
細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104 個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL 提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次);8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入
1mL 提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
2、 血清(漿)樣品:直接檢測。二、測定步驟:
1、分光光度計預熱30min 以上,調節波長至470nm,蒸餾水調零。
2、測定前將試劑一、二和三 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)放置10min。
3、樣本測定表
試劑名稱(µL)測定管
樣本15
蒸餾水270
試劑一520
試劑二130
試劑三135
在1mL玻璃比色皿中按順序加入上述試劑,立即混勻并計時,記錄470nm下30s 時的吸光值
A1和1min30s后的吸光值A2。計算ΔA=A2-A1。
注意:
a.若一次性測定樣本較多,可將試劑一、二、三和蒸餾水按比例配成混合液,在 37℃(哺乳動物) 或 25℃(其它物種)放置10min 以上,測定時加入15µL 樣本和1055µL 混合液測定。
b.如果ΔA 小于0.005,可將反應時間延長到5min。如果ΔA 大于0.5,可將樣本用提取液稀釋后測定,計算公式中乘以相應稀釋倍數。
三、POD 活性計算:
1、 血清(漿)POD 活性
單位定義:每mL血清(漿)在每mL 反應體系中每分鐘A470 變化0.01 為一個酶活力單位。計算公式:POD(U/mL)=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.01÷T =7133×ΔA
2、 組織、細菌或細胞 POD 活性
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位定義:每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。
POD(U/mg prot)=ΔA×V反總÷(V樣×Cpr)÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算
單位定義:每g組織在每mL反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。
POD(U/g鮮重)=ΔA×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞數量計算
單位定義:每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每分鐘 A470 變化0.01為一個酶活力單位。
POD(U/104 cell)=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V 樣總)÷0.01÷T=14.27×ΔA
V反總:反應體系總體積,1.07mL;V樣:加入樣本體積,0.015mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,1min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細菌或細胞總數,500萬。

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